文 | 清墨史纪
编辑 | 清墨史纪
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樟子松是月桂科最重要的常绿药用树种。作为一种本土植物，它主要分布在中国西南部，被中国濒危植物红皮书定义为濒危物种。
米高衣原体因其对血管性心病和胃痛的特殊功效，在贵州省被誉为名正宗药材。然而，野生资源的过度利用和米高梭菌的低发芽率导致个体在自然环境中罕见的再生。
此外，以前的研究和我们以前的研究实地调查发现，该物种的数量已经减少。
种子萌发被认为是植物幼苗建立的先决条件，是物种生命周期的关键阶段，种子萌发的过程始于成熟干种子的水分吸收，结束于胚根突起。
这一过程由几个复杂的生理、生化和分子过程的协调来调节，包括储存储备的动员、能量产生、信号转导和转录激活。
通常，种子必须经历三个重要阶段才能从静态成熟状态完成最终发芽。在最初的快速摄取之后，将水吸收到细胞中促进干燥种子的快速膨胀。
接下来，种子的生理和代谢过程开始，触发内部储存物质的动员，如蛋白质，脂质和淀粉。
随后，种子进入相对平台阶段，其中其内部代谢被进一步激活，导致大量线粒体的合成，DNA的修复和从头合成，储存蛋白的动员和降解，以及储存mRNA的翻译。
种子萌发随着胚轴的伸长和胚根的生长进入第三阶段，通常称为萌发后阶段。在种子萌发过程中，能量产生和呼吸起着至关重要的作用。
产生的初始能量主要通过无氧呼吸提供。随后，随着吸水过程中氧气的摄取和二氧化碳释放的加速，呼吸活动增加。
种子萌发的生理过程需要相当大的能量，细胞代谢的主要能量供应来自葡萄糖磷酸戊糖途径的生理意义是，葡萄糖通过后续过程分解代谢，即糖酵解和三羧酸循环，最后通过氧化磷酸化产生ATP。
二、转录测序对种子萌发的见解
种子萌发率与幼苗成活率及后续幼苗生长发育有较高的相关性，直接影响幼苗质量，生理和生化研究是种子发芽初步研究的主要关注点。
这些研究使我们能够对种子萌发过程中发生的主要生理变化和代谢过程的重新激活有一个基本的了解。
转录测序是了解复杂分子调控机制以及为种子萌发提供新见解的有效工具。该技术已在几种植物的种子萌发过程中进行，包括大麦芽、芸苔油菜、苏艾达旱芥和花椒。
木本植物种子萌发的分子机制仍然难以捉摸，特别是药用植物的分子机制，RNA-Seq技术是研究月桂科枸杞子分子过程的技术，为药用植物种子萌发提供有价值的见解。
三、转录组功能注释和表达分析
为了研究米高梭菌种子萌发的转录景观，我们进行了RNA-Seq分析了萌发四个阶段中转录水平的变化。从12个cDNA文库中过滤原始数据，所有样品的Q30>95%。
测序数据的汇编导致总共鉴定了78，832个单基因，N50的长度为1，560bp。为了获得有关组装转录组的全面信息，使用≤10的显著阈值E值。
根据对Nr、Swissprot、KOG、KEGG和GO数据库的相似性搜索对非冗余序列进行注释。− 5和爆炸算法。
每个数据库分布了78，832个单基因，其中Nr为31，313个，KOG为17，047个，SwissProt为19，363个，KEGG为12，305个，GO为9，284个。
不幸的是，在目前的研究中，47，302个单基因无法进行功能注释，这可能是由于在极其特殊的C.migao物种中存在独特的基因。
为了获得种子萌发过程中的转录动态表达模式，我们使用STEM软件对不同萌发阶段的差异表达基因进行分类。
共获得26个表达谱，其中12种不同的表达模式具有极显著性。使用分层聚类，我们将DEG分为七个共表达类，每个类都包含具有高度相似表达模式的基因。
12个表达谱的表达模式与7个共表达类的表达模式一致。Gz期C1和C2的基因表达水平较高，包括与糖体蛋白组成、氧化磷酸化和RNA转运相关的基因。
在C3和C4阶段，少数基因的表达水平在XS期上调，而C5中大量基因的表达水平在LK和MF期持续上调。
在C6和C7中，参与物质和能量代谢的基因表达水平在LK和MF期上调，在MF期达到峰值，这些结果与种子萌发过程中的生理变化一致。
四、DEG和基因本体与KEGG富集
我们对1个样品中单基因的转录水平进行了差异表达分析，以确定与种子萌发有关的潜在调控基因。
对DEGs的比较主要有两种方式，使用GZ作为参考点，即固定参考系，以及依次选择每个先前的相邻时间点作为参考点，即连续比较系统。
在米高种子的农民田间学校和CCS组中，分别获得了558，40和532，6个DEGs，8个基因的转录水平在LK期显著增加，而027，34个基因的转录水平在LK期下降。
在两个比较系统中，MF与GZ和LK与XS阶段的DEG分别占两组总DEG的6.96%和6.983%;其中，我们分别确定了54个和6个共享DEG。
GZ期和MF期种子的组织差异最大，而在整个萌发过程中，大多数DEGs从XS期开始;从XS到LK阶段的差异最为显著。
种子萌发中基因的转录表达水平分析表明，萌发过程中基因表达广泛，在种子萌发的CCS组中，观察到一致或相反的转录本调控特征。
包括RNA，转运，脂质代谢，蛋白质，碳水化合物，氨基酸代谢，细胞和细胞壁，上调基因主要参与RNA/蛋白质生物合成、脂质代谢、细胞呼吸、碳水化合物和营养吸收。
由于MapMan生成的功能分类仅限于具有假定的拟南芥同系物的基因，这些基因已被功能表征，因此我们还利用GO和KEGG注释来提供C.migao功能特化的进一步证据。
对于KEGG富集，XS与GZ，LK与XS和LK与MF阶段的DEG分别显着富集为86，132和114个代谢途径。
XS阶段的上调基因集中在内质网的蛋白质加工以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢中，XS期下调基因富集在核糖体、脂肪酸伸长和植物病原菌相互作用中。
LK期上调基因主要集中在甘油代谢、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途径和TCA互联网项目，LK期下调基因集中在内质网蛋白加工、ABC转运蛋白和植物激素中。
MF期的上调基因主要富集于甘油酯代谢、淀粉和蔗糖代谢以及糖酵解/糖异生，MF阶段下调基因集中在脂肪酸生物合成和次生代谢物生物合成中。
几个类别在不同的萌发阶段具有一定的特征。我们的数据为米高锦鸡儿种子萌发中与物质和能量代谢相关的基因表达提供了独特的全局视图。
五、种子萌发中的三酰基甘油代谢
含油量随种子萌发而变化，干种子含油量最高，3KEGG注释表明，97个DEGs被注释为种子萌发过程中甘油脂代谢，160个DEGs被注释为脂肪酸代谢。
其中，63个被注释为XS与LK中的脂肪酸降解，注释为三酰基甘油分解、编码三酰基甘油脂肪酶、醇脱氢酶和醛脱氢酶的DEG在LK和MF种子中表达更高。
在经历脂肪酸降解的DEG中，编码长链酰基辅酶A合成酶、ACOX、ACADM、MPF2、ACAA1和atoB的单基因在LK和MF种子中明显上调。
与GZ和XS种子相比，MGLL，ACSL和ACOX的表达上调了≥10倍。
六、种子萌发中的淀粉和蔗糖代谢
在萌发过程中，米高桫椤淀粉含量呈下降趋势，而SSC淀粉含量呈相反趋势。
在淀粉和蔗糖代谢注释的135个DEG中，大多数基因在LK与XS阶段差异表达，这些DEG在LK和MF阶段保持较高的表达水平。
编码异淀粉酶、α-淀粉酶、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、4-α-葡萄糖基转移酶、转化酶、果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶和磷酸葡萄糖变位酶的表达水平在LK和MF期显著上调。
其上调表达可能加速LK和MF期淀粉、麦芽糖和蔗糖的分解。淀粉和蔗糖代谢中仍有一些关键基因在LK和MF期上调。
包括编码蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖内切酶-1，3-β-D-葡萄糖苷酶内切葡聚糖酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶和海藻糖6-磷酸磷酸酶。
其中，ISA、GPI、SS和FK的表达水平提高了7-16倍，这些基因在MF期的表达水平高于LK期。
七、种子发芽期间的能量供应
种子中的脂类、淀粉和糖类通过种子的萌发逐渐分解，然后通过PPP、糖酵解途径、丙酮酸代谢、TCA循环和氧化磷酸化，尽管它们没有完全分解。
种子中大分子物质的分解产物通过改变这些代谢途径中关键基因的表达水平为种子萌发提供能量，葡萄糖在EMP中分解成D-甘油醛-3P和β-D-果糖-6P。
在PPP注释的49个DEG中，LK期单基因G6PD、PGLS和pfp的表达量比XS期高8-10倍，上述基因表达的变化可能加速LK期种子中葡萄糖的分解。
在EMP注释的32个DEG中，编码甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶的单基因在LK期上调。
编码丙酮酸脱氢酶E1、E2、苹果酸合酶、苹果酸脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的单基因在LK期上调。
MDH、maeB和ALDH的表达增加了8-13倍，在TCA循环注释的26个DEG中，编码柠檬酸合酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶和富马酸水合酶的单基因在LK阶段上调。
可能增加各环节代谢物的合成和分解，提高循环反应速度磷酸戊糖途径的生理意义是，加速LK期ATP和NADH浓度的调节，保证米高植种子萌发所需能量的供应。
这可能加速电子，H转移和氧利用效率，使种子在LK和MF阶段产生足够的能量用于种子萌发。
八、结论
樟子松是中国特有的濒危常绿木本植物。其果实被中国苗族用作传统药物，具有很高的商业价值。
在自然和人工条件下，其种子萌发率极低。种子萌发作为植物繁殖的基础，涉及一系列生理、细胞和分子变化。然而，米高种子萌发过程中发生的分子事件和系统变化尚不清楚。
本研究首次利用RNA-Seq对米高梭菌种子进行测序，揭示萌发过程中的基因表达模式。此外，还确定了米高种子萌发过程中转录水平变化的转录水平和顺序。
根据这些变化，可以确定不同萌发阶段在转录水平上发生的生物学事件。脂质代谢是最初被激活的主要代谢过程，在种子萌发中起重要作用。
接下来，激活与淀粉和蔗糖代谢以及能量供应途径相关的基因。同时，与抗氧化途径相关的基因表达增加，保持了适宜的萌发状态。
值得注意的是，通过评估细胞结构、生理指标和转录表达水平，结合qRT-PCR分析，进一步证实了种子的独特代谢序列。
