2018年22期
作者：陈玉梅，李璐璐，徐 媛，陈锦玲，李惠敏，秦新民*
单位：广西师范大学生命科学学院
简介：陈玉梅，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事植物分子生物学研究。
基金项目：国家自然科学基金项目(31360477)；广西教育厅项目(2013YB036)。
SAURs（small auxin up RNAs）基因属生长素早期响应家族基因三大基因，为植物所特有，在植物的免疫应发、胁迫应答、转录和转录调控等过程中发挥重要的作用。大部分SAUR家族的基因都没有内含子，含有1个或多个生长素反应元件AuxREs。SAUR基因含有1个下游元件DST，它会导致其编码的mRNAs极不稳定，易在短时间内被降解。SAUR基因具有1个Auxin-inducible结构域，参与植物的生长素调节活动。
沙田柚（Citrus grandis var.Shatinyu Hort）是配子体高度不亲和果树。目前创业项目，多种植物的SAUR基因已被克隆，但鲜见关于沙田柚SAUR基因克隆的报道。
目的
研究沙田柚生长素响应基因SAUR基因编码的蛋白质序列所包含的生物信息学，旨在为深入研究沙田柚自交不亲和性的分子机制提供依据。
方法
以沙田柚自交和异交花柱为材料，通过高通量测序技术进行转录组测序，在差异表达基因中鉴定出SAUR基因。
结果
◆开放阅读框预测
沙田柚SAUR基因（Unigene8616_All）序列全长为857bp（GenBank登录号为MH281940），通过NCBI ORF Finder和生物信息学软件DNAman进行分析，该序列的开放阅读框为381bp，编码126个氨基酸（图1）。
图1 Unigene8616_All序列和推测氨基酸序列
◆功能结构域分析
将编码的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search（）分析，结果表明，该基因转录的蛋白质具有1个与Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守结构域（图2）。
图2 Unigene8616_All蛋白保守结构域
◆表达模式分析
SAUR基因在沙田柚未授粉、自交和异交花柱中差异表达较为明显：在未授粉花柱中其表达量（RP-KM）为5.10，自交（ZJ）1、2、3d花柱中的表达量分别是8.42、56.02、53.45，其表达量在自交2d中迅速上升，并维持在较高水平。而在异交（YJ）1、2、3d花柱中的表达量分别是11.98、36.74、8.53，其表达量在异交2 d中上升后则迅速下降。
利用RPKM对该基因在自交和异交花柱中的表达水平估算asp氨基酸，设定FDRS≤0.001且差异倍数≥2倍的基因为显著差异表达基因，以RPKM值取2的对数值［log2（RPKM）］对ZJ1/YJ1（8.42/11.98），ZJ2/YJ2(56.02/36.74)，ZJ3/YJ3(53.45/8.53)花柱中SAUR基因的表达水平进行统计分析，其log2(RPKM ratio)分别为-0.51、0.61和2.65。此外，在沙田柚自交和异交1~3d的花柱中，该基因的表达量均明显高于未授粉花柱。
◆编码蛋白质的分析和疏水性预测
通过DNAman软件和在线软件（）分析，该基因编码的蛋白质分子式为C599H946N166O190S7，等电点pI为5.76，分子质量为13.74kD，不稳定系数为59.75（＞40），属于不稳定蛋白。其中，该蛋白质携带的负电荷氨基酸(Asp + Glu)总数为17，正电荷氨基酸(Arg + Lys)总数为14。该基因编码的肽链中疏水性最大值约为2.33，位于第97位氨基酸，最小值约为-3.25，位于第62位氨基酸，该蛋白质疏水性平均值为-0.30，鉴定该蛋白质为亲水性蛋白，其疏水性分析结果见图3。
图3 Unigene8616_All蛋白疏水性分析
◆跨膜预测
运用跨膜蛋白数据库 TMHMM（）对SAUR基因编码的蛋白进行跨膜区域预测，结果表明该蛋白不属于跨膜蛋白。
◆蛋白质的二级结构和三级结构预测
通过在线软件SOPMA分析该蛋白质的二级结构，该蛋白的α-螺旋占39.68%、延伸链占19.05%、无规则卷曲占41.27%（图4）。
注：h为α-螺旋；c为无规则卷曲；e为延伸链
图4 Unigene8616_All蛋白的二级结构预测
运用在线软件（）预测该蛋白的三级结构asp氨基酸，该蛋白三级结构包含了2个α-螺旋，由无规则卷曲连接（图5）。
图5 Unigene8616_All蛋白的三级结构
◆蛋白质的磷酸化位点预测
通过在线软件NetPhos 3.1 Server对沙田柚SAUR基因编码蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明该基因编码的蛋白质可能的磷酸化位点共有10个（Ser），分别位于肽链的12、19、30、50、61、69、84、85、88、116位。
◆同源性分析
将沙田柚SAUR基因编码的氨基酸序列与GenBank数据库中下载的其他11种植物SAUR基因编码的氨基酸序列进行比对，结果表明，沙田柚SAUR基因编码的氨基酸与克莱门柚（Citrus clementina,XP_006452877.1）和甜橙（Citrus sinensis,XP_006474595.1）SAUR基因编码的氨基酸序列的同源性分别为100%和99%。利用DNAman软件构建系统发育树，结果表明沙田柚SAUR基因编码的蛋白质与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近，属于同一进化分支（图6）。
注：Citrus clementina（克莱门柚，XP_006452877.1）；Unigene8616_All（沙田柚，MH281940）；Citrus sinensis（甜橙，XP_006474595.1）；Prunus avium（樱桃，XP_021805069.1）；Prunus mume（梅，XP_008242289.1）；Prunus persica（桃，XP_007204762.1）；Durio zibethinus（榴莲，XP_022731960.1）；Theobroma cacao（可可，XP_007012549.1）；Populus trichocarpa（毛果杨，XP_002303770.1）；Jatropha curcas（麻风树，ADU56197.1）；Rosa chinensis（月季，XP_024194724.1）；Morus alba（桑树，AGR44724.1）
图6 基于氨基酸序列的Unigene8616_All蛋白系统发育树
结论
该研究的Unigene8616_All序列与克莱门柚和甜橙的SAUR基因的同源性分别为100%和99%，同时含有1个Auxin_inducible保守结构域，说明Unigene8616_All序列是1个SAUR基因。
研究发现，在体外SAUR蛋白能够与钙调蛋白结合，说明SAUR蛋白可能作为第二信使传导钙/钙调蛋白和生长素信号之间的联系，生长素作用之后SAUR基因编码的转录产物能够迅速积累。
沙田柚自交花柱中SAUR的表达量在授粉第2、3天明显高于异交花柱，推测在沙田柚自交过程中SAUR基因被激活后迅速上调表达，SAUR蛋白与钙/钙调蛋白结合，产生级联反应，参与自交不亲和过程。
